王晓花

　　抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）主要是CD8+T细胞，少数为CD4+T细胞，CTL对抗原的识别及自身的活化受MHC分子的限制。抗原特异性CTL在抗感染免疫、移植物免疫和肿瘤免疫中发挥重要作用。定量分析抗原特异性CTL可为阐明免疫应答的自然发生过程提供重要信息。但是传统的检测分析方法均为间接的活性测定，费时费力，1996年Altman等[1]首创的可溶性MHC-肽四聚复合物法则能够直接定量检测抗原特异性CTL的比率。并通过流式分选用于其他方面的研究。操作简便，灵敏度、特异性很高，因而得到广泛应用，以下就是原理、应用及技术改进简述之。
　　一、基本原理
　　由于可溶性MHC单体分子与T细胞受体（TCR）的亲和力很低。解离快，无法用免疫荧光法标记特异性TCR分子，而多价分子可与一个特异性T细胞上的多个TCR结合，使其解离速度大大减慢，从而提高检测的阳性率。Altman等[1]基于以上原理并借助生物素-亲和素级联放大原理构建了四聚体，该方法通过基因工程技术把长度为15个氨基酸的BirA底物肽（BSP）加在人白细胞抗原（HLA）A2重链的羧基端形成融合蛋白，在体外按一定比例与β微球蛋白及特异的抗原短肽共孵育，使其折叠成正确的构象，成为MHC肽复合物。再经过纯化，把生物素标记在底物肽的赖氨酸残基上，使一个标记荧光素的链亲和素与4个生物素标记的MHC肽复合物结合形成四聚体，MHC肽四聚体与抗原特异性CTL上的TCR结合后，即可以通过流式细胞仪（FACS）进行检测。因此，只要人工合成各种特异性抗原，即可通过此法迅速定量检出体内抗原特异性CTL，并能将其分选出以供体外培养扩增和功能分析之用，加之FACS检测灵敏度高（数万分之一），使得四聚体技术大大优于传统的T细胞检测技术。
　　二、应用
　　1．定量检测外周血及组织中抗原特异性CTL的比率，并对其进行表型及功能分析
四聚体技术最早应用于HIV特异性CTL的研究。Altman等[1]在大量无症状AIDS患者体内检测到抗原特异必CTL，其检出率高达2%。以记忆及效应细胞表型占优势。且与全外的细胞毒效应一致。Jin等[2]在巨细胞病毒（CMV）感染者中该数值可达40%，但这些急性抗原特异性CTL在活体急剧下调并走向凋亡，仅代表了短寿命的终末期效应细胞。此外，在HBV、HCV、HSV、LCMV等感染者体内也检测到一定数量的抗原特异性CTL。
　　四聚体技术可用于原位染色检测肿瘤局部和肿瘤浸润淋巴结（TILN）中抗原特异性CTL。Zerbini等[3]应用四皮聚体技术及免疫组化的方法首次在肝细胞肝癌（HCC）患者肿瘤组织中检测到MAGE-1/-3肽特异性的CD8+CTL，这种CTL可以识别MAGE-1序列161~169和MAGE-3序列271~279，并受HLA-A1/A2限制。对于其中一个特异性CTL比率异常高（7.8%）的患者进行了表型和功能分析,显示以新近激活的T细胞(CD28+CD27+CD45RA-CCR7)为主,所观察到的HCC患者体内MAGE抗原特异性T细胞反应自发激活现象以及该抗原在肿瘤组织中高表达的现象,无疑为针对MAGE抗原的免疫治疗在HCC中的应用提供了广阔的前景.
　　在自身免疫性疾病中四聚体原位染色最早用于TCR转基因小鼠,后来成功地用于检测猿猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的短尾猿体内多组织中Gag和Tat抗原特异性的CD8+T细胞.Stevceva等[4]应用针对SIV免疫显位Gag181~189CM9的四聚体对15位感染有SIVmac215患者的不同组织及上皮内淋巴细胞(IELs)进行标染,发现在直肠、结肠、空肠和阴道上皮下分离也的IELs中可以检测到不同比率的Gag特异性CD8+T细胞（结肠1.58%~8.27%,直肠4.01%~6.47%,阴道0.3%~6.33%）,原位染色在完整的肠道上皮层也检测到相同来源的CTL,表型及功能分析显示上述CTL表达活化标志CD69,且具有分泌INF-γ的能力.这表明在感染组织局部中有活跃的免疫反应.通过对抗原特民性CTL的定量检测、表型及功能分析,为阐明病毒感染性疾病、肿瘤及自身免疫性疾病的发病机制奠定了基础,也使得该技术广泛用于临床成为可能.
　　2.诊断价值和治疗方面的探讨
　　四聚体技术可以作为临床诊断的工具:如在对白血病患者进行异基因干细胞移植(SLT)治疗时,尽管在有效的抗病毒药物治疗的同时仍然会发生CMV感染,尤其是移植以后头两个月,因此,通过四聚体检测受到体内针对CMV的特异性CTL,做到早期诊断及预防是至关重要的.再如对同种异型骨髓移植后出现的移植物抗宿主反应(GVHD)的监测,在移植后14d内即可检测出抗原特异性CTL,从而了解对GVHD的临床疗效.
　　四聚体技术用于过继性肿瘤免疫治疗:如Mei-denbauer等[5]将大量高活笥的Melan-A肽特异性CTL(42.1%).静脉输注给8例难治性恶性黑色素瘤患者,结果发现外周血单核细胞(PBMC)中抗原特异性CTL的比率由输注的0.01%~0.07%升至输注后的2%.而且这些细胞能在活体内完整存活数周,具有分泌INF-γ功能并优先聚集到肿瘤局部发挥作用,这无疑为过继性肿瘤免疫治疗提供了新思路.
　　四聚体技术可用于疫苗疗效的监测:近年用抗原肽冲击的DC作为疫苗免疫机体从而诱发有效的CTL反应成为研究热点,如Matsuda等[6]用HLA-A24限制性的抗原肽段CEA652(TYACFVSNL)在体外冲击DC后,再将后者皮下注射给8例高表达癌胚抗原(CEA)的胃肠道恶性肿瘤患者,然后用细胞内细胞因子染色法(ICCD)和同源肽构建的四聚体监测,结果发现患者外周血中CEA652特异性的CTL前体细胞(CTLp)的比率和抗肿瘤活性明显提高和增强,有3例患者免疫后病情较前稳定,3次免疫之后除有1例有轻微的腹泻之外其余没有明显的毒副作用,从而说明该疫苗安全有效.
　　3.分子水平的研究
　　表位的寻找:由Novak等[7]成功的应用四聚体技术针对HSV-2 VP16蛋白和T细胞表位的鉴定.在应用TGEM(tetramer-guided epitope mapping)之前需先检测出患者HLAII的配型,并合成一批包含有目的的抗原蛋白(如VP16)的重叠肽段,然后,将这些重叠肽段分组,每组由5~10种不同的肽段组成复合肽,用这种复合肽与可溶性MHCII类分子构建四聚体,同时用目的抗原蛋白与患者的PBMC共孵育以获得相应的抗原特异性CTL.继之以上述复合肽构建的四聚体标染PBMC并进行流式分析,染色阳性组被挑选出来,现用阳性组中的单个肽段构建四聚体,并用此单肽四聚体二次标染上述相同来源的抗原特异性CTL,流式分析,阳性者即说明该单肽包含有目的抗原表位.Novak用TGEM鉴定出8种以上针对II等位基因的不同T细胞表位.此后的研究表明,将计算机预测与TGEM相结合不失为一种简化检测策略的好方法.
　　四聚体技术与TCR样抗体技术相结合的应用:四聚体技术与TCR样抗体技术结合可用于研究TCR配体,即MHC I-抗原肽复合物在抗原提呈细胞(APC)肿瘤细胞、病毒感染细胞、肿瘤感染细胞、肿瘤转移组织及邻近靶器官表面的数量、分布及基佤TCR的相互作用.TCR抗体技术是利用一个巨大的人类抗体噬菌体展示库分离出一大批重组抗体,这种重组抗体能够特异性识别某种特殊的结合在肿瘤细胞、APC及病毒感染的细胞表面的MHC I-抗原肽复合物,并借助流式细胞将其检测出来[8].因此,用这种方法不仅可以将四聚体定位于肿瘤或病毒感染细胞表面从而介导CTL的杀伤作用,而且可以通过构建重组免疫毒素、细胞因子融合蛋白等用于抗体介导的靶向性治疗.
　　此外,四聚体技术尚可用于CD8其刺激分子及NK细胞的相关性研究.治疗用模拟抗原设计及其诱导外周血CTL活性的研究等.
　　三、技术改进
　　构建过程的简化：四聚体的早期构建是将生物素连接在MHC I类分子重链羧基端，由于MHC分子素连接在MHC I类分子重链羧基端，由于MHC分子的多态性，在研究每一种特定类型的MHC I类分子时都要重新构建载体，致使该项工作较为复杂。Walter等[9]构建了一个β2-M的突变体（67位的酪氨酸突变为半胱氨酸），该突变在体外与MHC分子及短肽形成MHC肽复合体，并借助于半胱氨酸和巯基与生物素结合，然后一个标记荧光素的链亲和素与4个标记生物素的MHC肽复合体结合形成四聚体，由于β2-M是保守亚基，只需构建1次载体即可，困此这种四聚体适用于多种MHC I类分子，大大简化构建过程。Kalergis等[10]在重链H-2Kb分子末端连接一个非配对的Cys残基，再以-SH特异的生物素化试剂使该位点的游离Cys生物素化，由此构建的H-2Kb/VSV四聚体只能特异性结合表达H-2Kb/VSV特异性TCR的杂交瘤细胞，具有良好的特异性，此法过程简单，价格低廉，特异性好，实用性强。
　　染色效率的改进：四聚体技术虽然具有很高的灵敏度和特异性，但是在慢性病毒（尤其是HBV和HCV）感染者新鲜PBMC中通常只能检测到比率极低（一般＜1%）的抗原特异性CTL。这对于不同个体间的分析比较十分困难。Tsai等[11]建立了一种改良的细胞毒性T细胞抗原肽反应指数（CRI-p）培养方法，这种改良的CRI-p培养方法提高了四聚体标染法，这种改良的CRI-p培养方法提高了四聚休标染率，这慢性病毒感染抗病毒治疗的疗效观察提供了有力的工具。
　　检测结果的标化：Wolfl等[12]建立了一种借助于Trucont管的单平台，四色流式细胞仪分析的方法，可迅速直接地从患者外周全血中检测到四聚体染色阳性细胞的绝对数，且背景染色很低，检测结果十分可靠，从而使得不同实验条件下所得结果具有可比性。
　　四、 结语
　　四聚体技术解决了长期困扰免疫学界的诸多难题，使抗原特异性CTL活性检测达到特异、高效和直接定量的程度。为细胞免疫应答开辟了新途径。四聚体技术与免疫组化技术相结合进行原位染色、与非流式细胞仪荧光扫描技术相结合在单细胞水平同时监测MHC-肽复合物与T细胞的结合与活化、与TCR样抗体技术相结合在分子水平的研究是其应用新进展。构建HLAII类分子四聚体探索CD4+T细胞应答的研究也逐渐开展起来，同时该技术本身也不断的改进，成为一种更为有效的科研工具。

摘自：《中华微生物学和免疫学杂志》2005年1月第25卷第1期