刘坤 姜颖 贺福初

　　随着大量生物体全基因组序列的获得，特别是人类基因组序列草图的完成，人们发现仅从基因序列的角度根本无法完整、系统地阐明生物体的功能，很多生命现象之谜，不能直接从基因序列中得到解答，由于蛋白质是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者、在疾病发展过程中，基因的作用更多依靠基因的表达，表达产物的修饰和它们之间的相互作用来完成，所以蛋白质组学的研究受到人们越来越多的关注，蛋白在疾病中的重要作用使得蛋白质组学在人类疾病的研究中有关极为重要的价值，目前其已被广泛应用于各种疾病的研究中[1]。
　　肝脏是人体各种物质代谢，能量转换及供应的枢纽和主导器官，是机体内多种重要信息调控分子的“集散地”。肝脏疾病严重影响人类健康，并对社会经济产生巨大影响。据世界卫生组织统计，全球20亿人曾经或当前感染乙型肝炎病毒（HBV），其中有近3.5仇人为HBV携带者.尤其是中国、东南亚等国家，约10%的人携带HBV。肝病中、肝炎、肝硬化和肝癌关系一直引人注目。5年随访研究表明，慢性乙型肝炎病人肝硬化发生率为2%~20%，代偿性肝硬化发展成失代偿性肝硬化为20%~23%，发展成肝癌的占6%~15%，研究肝炎、肝硬化和肝癌间的因果关系，演变规律及其待征表现，将为三种病的早期预警、诊断、治疗及预后提供依据，从而可能从根本上改变有病的诊断和治疗水平。
　　目前肝病蛋白质研究领域中比较胶前景的是：描绘生理，病理条件一，组织、细胞或亚细胞、蛋白质复合物及体液中蛋白质表达的改变；寻找用于早期诊断的生物标志物及药靶，探索疾病发生发展的机理等[2]。
　　一、蛋白质组学在肝炎研究中的进展
　　肝炎多由病毒感染造成，酒精滥用，使用药物或摄入了环境中的有毒物质等也可以引起肝炎，而HBV感染是肝炎的主要诱因之一。尽管许多HBV标志肝炎，如乙型肝炎病毒表面抗原抗体（HBsAg）、e抗原、e抗原抗体等用于诊断和监控疾病进程，但目前还没有单一的特异的血清学指标的方法寻找HBV感染的明确诊断。He待试图用蛋白组学的方法寻找HBV感染导致肝炎的血清标志物。目前，通过对比正常和HBV感染病人的血清，发现结合珠蛋白β和α2链、载脂蛋白A-I和A-Ⅳ、α1-抗胰蛋白酶、transthyretin和DNA拓扑异构酶Iiβ等7种蛋白水平发生了改变，这些蛋白改变不仅表现在量上而有些蛋白的表达模式或特异性也发生了改变[3]。
　　I型自身免疫性肝炎（AIH I型）是目前病因不明的一种慢性肝脏疾病，多发于女性，预后差。研究认为抗核自身抗体（ANAs）在AIH I型诊断有重要价值。基于蛋白组学相对基因组学的优点，Huguet等用蛋白质组学方法寻找AIH I型中ANA的靶蛋白，通过对29例AIH 型病人和14名正常人血清研究发现两种主要抗原：即分子量30000（在79%R 病人和14%正常人血清中发现）。对后者进一步研究后，鉴定该抗原为核不均一核蛋白A2/B1[4]。
　　二、蛋白质组学在肝硬化研究中的进展
　　肝硬化是一种或多咱致病因素持久或反复损害肝脏组织所致的疾病，这些因素包括慢性病毒感染、滥用酒精以及非酒精性脂肪肝等。这些致病菌因素可导致胞外基质蛋白累积，纤维性结世形成，以及肝脏正常结构改变和再生肝细价肝脏损伤和肝硬化的程度，但这种方法具有很大的局限性。因此，很有必要发展“非侵入性”方法（如血清检测）来代替肝组织切片检测。
　　Zhu等对25例HBV导致肝硬化病人、20例HCC病人和25名匹配健康人的血清经表面增　　强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）检测。发现了2种潜在的生物标志物，分子量分别为7772和3933。如将这2种潜在的生物标志物应用于临床，将可简化肝硬化诊断。
　　Xu等采用SELDI-TOF-MS的方法寻找大鼠模型肝硬化分级的生物标志物，通过对8只正常、22只硫代乙酰氨导致的肝硬化和5只胆管结扎导致的肝纤维化大鼠的血清进行分析，寻找统计学分析差异显著的生物志物，结果发现1个分子量为3495的蛋白，该蛋白在肝硬化过程中的的量持续下降。经质鉴定，该蛋白与1个富含组氨酸的糖蛋白同源[7]。
　　三、蛋白质组学在HCC研究中的进展
　　HCC是世界上发病率上升的疾病之一，也是主要的肝脏肿瘤疾病，各种肝硬化、HBV和丙型肝炎病毒（HCV）慢性感染与HCC发病的高危度相关，该病早期诊断困难，5年生存率<5%,目前除手术切除外,仍无很好的治疗方法,因此,寻找用于人群筛查的的早期诊断生物标志物,治疗药靶以及探讨HCC形成的机理是重中之重,目前,蛋白质组学在描绘HCC组织、细胞或亚细胞水平蛋白质表达的改变、寻找早期诊断的生物志物、潜在药靶及探索疾病发生发展的机理等方面都取得了一些进展。
　　（一）全谱描绘蛋白质的表达研究
　　Seow等以整合有HBV基因组的肝癌细胞系HCC-M进行全谱分析，CF 408个点进行MALDI-TOF-MS鉴定，其中301个点得到了较好的质谱峰，经去冗余数据库检索，其鉴定出由191个基因编码的272种蛋白，其中包括一些管家蛋白，如乙醇脱氢酶、α-烯醇酶、天冬酰氨酸全成酶、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶等；还有一些推测与肿瘤发生相关的蛋白，如14-3-3蛋白，膜联蛋白，抑制素和硫氧还蛋白过氧化物酶等。此我，有29个具有较好质谱峰的点在数据库中没有找到匹配的结果，经nESI-MS/MS和de novo测序。全部得到鉴定，其中包括已经报导与肿瘤相关的蛋白磷酸酪氨酰磷酸酶启动因子（PAPA）、RAN结合蛋白调节亚基，复制蛋白A32000亚基（RP-A）和N-唾液酸磷合成酶[8，9]，Liang等总结了他人和自己的工作，建立了肝癌细胞系HCC-M双向电泳（2-D）蛋白质组数据库（http：//proteome.btc.nus.edu.sg/hccm/）[10].这种对组织/细胞全谱蛋白质组的扫描,将加快诊断标志物的治疗靶标的寻找,并为后者提供第一手数据.
　　(二)诊断标志物的药靶的寻找
　　既往对HCC进行早期诊断主要超声检测,这种方法存在很高的假阳性,寻找早期诊断的标志物的是一个更好的策略. α-胎蛋白(AFP)曾是用于HCC检测的惟一标志物,但AFP的灵敏度较低(39%~64%),阳性预测率为9%~32%.因此,有必要寻找更有效的肿瘤标志物,现在,人们已经在细胞、血清和组织水平开展了蛋白质级学研究。
　　1．细胞水平的蛋白质学研究：Yu等对比肝瘤细胞系BEL-7404和人正常肝细胞系L-02的2-D图谱，找到99个质和量存在显著差异的点，经高效和液相色谱离子阱-质谱（HPLC-IT-MS）获得串联质谱图，其中有12个蛋白点的原始MS/MS资料经SEQUEST被鉴定出来，即次黄嘌呤-5′单磷酸脱氨酶2、热休克蛋白27、钙网硬蛋白和钙调蛋白在肝瘤细胞中表达上调；谷胱甘肽-S转移酶P在肝瘤细胞中的量是正常肝细胞和18倍；但是微管蛋白β-1链和自然杀死细胞促进因子B在肝瘤细胞中下调；在正常肝细胞中鉴定出1种起肿瘤抑制作用的丝氨酸蛋白激酶抑制剂（serpin）-maspin前体，其表达量非常高，而且在正常肝细胞系中检测到表皮脂肪酸结合蛋白（E-FABP）和脂细胞型脂肪酸结合蛋白（A-FABP），但在肝瘤细胞中没有检测到[11]。Chew等对正常肝、肝癌细胞系-HepG2和HCC的核基质蛋白经2-D分析，发现三者核基质蛋白图谱非常相似，同时鉴定出2咱HCC特异的核基质蛋白，其中HCC-1（分子量62000，Pi5.3）在所有肿瘤中都存在；HCC-2（分子量33250，pI5.3~5.5）在11例病人中有9全存在,但在正常肝和HepG2中不存在.这2种蛋白或许可作为HCC的生物标志物[12].
　　2.血清水平的蛋白质组学研究:Poon等对20例AFP<500ug/L的慢性肝病病人和38例HCC病人的血清经阴离子交换,两种类型蛋白芯片(IMAC3铜和WCX2)检测,及SELII-TOF-MS鉴定.在2384个蛋白点中发现有250个点在慢性肝炎病人和HCC病人间存在显著差异[13].Steel等用一种新的策略对比血清蛋白质组,以寻找HCC生物标志物,首先,他们按照临床上患HCC危险性的不同,分别对健康组、无活性慢性HBV携带者组，HCC组有2个点相对大量的减弱，经质量指纹图谱鉴定，分别是补体C3的羧基端和载脂蛋白A1的异形体。然后，对4组中每个个体的血清进行2-D分析，以验证组间差异[14]。而Comunale等则根据去糖基化可减少糖基异构体的数目，用去N-糖基化的方法简化血清蛋白组图谱以寻找BHV相关HCC的诊断标志物。他们用该方法对正常人、慢性HBV推带者，慢性活性HBV携带者和HCC病人的血清进行检测。发现2种肽只在去N-糖基化后有可能成为诊断标志物。一个与HBV感染呈正相关，另一个与HCC呈负相关。这2个多肽经鉴定，一个是血浆酮蓝蛋白的1个片段，它在7名健康人中没有发现，但在26例HBV感染的病人中均被发现，而在去N-糖基化前并未被发现，另一个是前血清淀粉体P组件，在健康组都存在，但在HCC病人中不存在，而此蛋白在去N-糖基化前，其量的减少就可被发现，在去N-糖基化后，其在胶上的位置迁移到空旷的位置，使得分析变得容易[15]。
　　3．组织水平的蛋白质组学研究：Seung等通过比较HBV和HCV相关的HCC差异表达的蛋白质组来寻找病毒特异性HCC形成的生物标志物，他们将21例HCC病人的21对样品（肿瘤和肿瘤旁肝组织）分为3组：7对HBsAg阳性；7对抗HCV阳性；7对HBsAg和抗HCV均为阴性，总蛋白经MALDI-TOF-MS分析，结果鉴定出60个蛋白在肿瘤的非肿瘤间表面出显著的表达量的变化，其中14个蛋白在所有3组中表面出同样的变化，但另外46个蛋白表面出病毒特异性趋势[16]。Lin等对比了正常肝脏组织、HBsAg阳性的肝硬化病人和HCC病人的肝脏组织的蛋白质组，发现21个蛋白点的表达发生了显著改变。肌氨酸脱氢酶、肝脏羧酸酸酶、脯氨酸肽异构酶A和核纤层蛋白B1可作为HCC的候选生物标志物[17]。Zeindl-Eberhart等[18]将人HCC样品经2-D分离，切取分子量约30000~40000/pI6.2~7.8的区域中，大约90个点进行肽质量指纹图谱分析，找到6个变异体蛋白，它们都属于呋喃酮还原酶超家族，分别为醛糖还原酶、人醛糖还原样蛋白（hARLP）1~5。经免疫印迹和免疫组化分析，95%和HCC样品对hARLP家族反应呈阳性，提示hARLP可以作为HCC诊断的免疫组化标志物。
　　现在，尽管目前人们已经从大量研究中找到了一些潜在的肿瘤标志物的药靶，但是还需要大量临床验证予以确认。
　　（三）探索疾病发生的机理研究
Ding等为研究HCC转移的机理，用差异蛋白组学的方法对比分析了具有不同转移潜能的2种HCC细胞系MHCC97-H和MHCC97-L的蛋白质组。经MALDI-TOF-MS和LC-IT-MS分析，共发现56个蛋白点在2种细胞中存在显著差异，有4个点只在MHCC97-H细胞中被发现，他们对其中14个点进行鉴定，结果显示，这些蛋白都是已报导的参与肿瘤转移的蛋白，按其功能可以分成5类，分别是细胞骨架及相关蛋白，胞外基质降解相关蛋白、钙结合蛋白、碳水化合物代谢酶类和恶性生和工相关酶类[19]。这为研究HCC转移这一复杂过程提供了新的信息。Park等则用蛋白组学的方法研究人HCC过程中铁损耗的分子机制，他们以19例HCC病人肿瘤组织作MALDI-MS分析，与临近非肿瘤肝脏组织作对照，结果发现，铁存储蛋白组织铁蛋白轻链（T-FLC）在HCC中量很低，甚至检测不到，用免疫印迹法和免疫过度表达。经实进定量逆转录聚合链式反应（RT-PCR）分析发现，T-FLC的mRNA水平并没有发生显著变化，表明是翻译或翻译后修饰造成T-TLC的表达受到抑制[20]。即用蛋白质组学方法为这一悬而未决的问题提供了新的线索。
　　综上所述，由于蛋白质组学研究的是生命活动直接的执行者——蛋白质，因此更接近生理或病理的本质。用蛋白质组学方法对生理或病理过程进行研究，具有很大的潜力！蛋白质组学是建立在基因组技术和蛋白质分析和分离技术上的巨大进步，蛋白质组学概念的提出至今已有十年的时间，在这十年中，蛋白质组学取得飞速的发展，并广泛应用于各种疾病的研究，从最初基于2-D电泳发展到基于色谱的各项分离技术，以及多种差异分析技术，如ICAT、SELDI等的引入，使蛋白质组学在寻找疾病诊断标志物和治疗药靶方面都取得了一定的进展，并预示了良好的发展方向。但蛋白质组学毕竟还处在发展分阶段，蛋白质组在提高通量化、低丰度蛋白质的分辩率，及增加质谱分析小量样品的灵敏度上仍需要进一步完善。
　　我国是肝病高发地区，控制肝病的发生发展和提高病人生活质量事关国计民生，这对现代医学院提出了巨大的挑战。2004年底美国家卫生研究通过了一项计划来推动癌症标志物的寻找　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（http：∥www.nci.nih.gov/newscenter/pressreleases/ProteomicBiomarkerAwards/）.面对国内忧患,国际竞争,我们更应抓住机遇,加倍努力进行相关基础和应用研究.周时,利用蛋白质组技术为全面认识肝脏及其疾病所提供新的历史性机遇,通过深入的肝脏蛋白质组研究,发现一批肝脏病症的新型诊断生物标志物,药物作用靶标的创新药物.

摘自:《中华检验医学杂志》2005年5月第28卷第5期