李金明

　　聚合酶链反应（PCR）技术自1983年问世以来，因其对基因或特定核酸序列的时间内具有极大的扩增效率，已广泛应用于感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、法医学、动植物和考古等诊断和研究领域，并在某些方面呈现出几乎难以替代的优势。PCR用于疾病的临床诊断后，使人们对蛋白分子表型的认识，进一步深入到了遗传物质——核酸分子的探索，也使临床检验诊断科澡的临床分子诊断得到了飞速发展。像任何自然界的事物一样，PCR虽然有其无可比拟的优点，但也有其一定的局限性，如果在临床实际应用中，不遵循客观规则，也很容易产生非PCR技术问题所致的错误检验结果。
　　一、PCR在临床疾病诊断中的应用
　　感染性疾病由病原微生物所引起，致病的病原微生物主要有病毒、细菌、衣原体、支原体和螺旋体等，在PCR出现以来，这些病原体通常采用培养、免疫学方法测定特异抗原抗体，或用核酸杂交等进行临床检测。但对结构分枝杆菌、沙眼衣原体、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）等某些难以培养的病原体，抗原抗体检测也不能判断体内病原体DNA或RNA的复制情况，或存在检测灵敏度低等问题[如HBV、HCV和人免疫缺陷病毒（HIV）等的抗原抗菌素体检测及核酸杂交检测等]。PCR的出现，可以说从根本上解决了这类问题，其极高的检测灵敏度和特异笥，使存在于血液、痰、尿液、粪便等临床标本中的极微量的难培养病原体的检测变得迅捷而又准确[1-4]。各种定量PCR，如实时荧光PCR、内标定量PCR等的出现，又使对抗病毒疗效的判断达到病毒核酸的量化水平[2，4]。PCR用于病原体感染的血液筛查，还可检出抗原抗体尚未出现的“窗口期”的感染，从而避免经输血感染性疾病的传播[5]。国外从上个世纪90年代中期，开始尝试将PCR方法用于HBV、HCV和HIV感染“窗口期”的血液筛查，并发现有一定的感染率。近年来，国内也有一些这方面的探讨[6]。PCR用于血液筛查，对于提高临床输血的安全性有重要的应用价值。些外，对于致病微生物的耐药性，毒素和致病力的检测亦不失为一个有力的工具[7]。
　　遗传基因的异常可致遗传病的发生。遗传病分为单基因、多基因及染色体遗传病。人类遗传病已有数千种之多，携带致遗传病基因者约10%。这些遗传病（如血友病、地中海贫血等）通常由基因突变、基因缺失、染色体错位所致。在进行家系谱分析、染色体检查、生物化学分析等基础上，有用PCR方法可在很短的时间内将靶DNA扩增数亿倍，再结合其它多种分子手段，如探针杂交、各种电泳、高效液相层等已可检出大部分已知的基因突变、基因缺失、染色体错位等疾病，故PCR方法已成为遗传病实验诊断的最有效、最可靠的方法之一[8-11]。
　　基因指纹又称DNA批纹，系指单基因座探针限制性片段长度多态性。DNA所含有的遗传信息是由遗伟密码——碱基A、C、G和T的序列决定，它们在人体每个细胞的染色体上都以一定的次序排列，排列次序的不同使每个个体完全不同，个体间的亲缘关系相距越远，基因组的碱基排列差异就越大。DNA指纹技术可通过分析这种差异确认个体，人的指纹可以消失或通过外科手术加以改变，而他的DNA则无法更改。法医学也因为PCR技术的出现，进入到对血斑、精斑、毛发、组织碎片乃至微量残留细胞等分子物证确认时代，法医学也因为PCR技术的出现，进入到血斑、精斑、毛发、组织碎片乃至微量残留细胞等分子物证确认时代，此方法远较以前的血清学方法（如血型鉴定）确实可靠，且可对极少量物证，如一要毛发、一滴血液、极小精斑、体液中的脱落细胞等进行分析和个体确认。因而在法医物证鉴定中发挥着重大作用[12、13]。
众所周知，肿瘤与遗传有关，除已知的单基因遗传肿瘤，如视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤等外，几乎所有的肿瘤细胞中都可以观察到原癌基因的重排，这些基因的变化常导致细胞增殖的凋亡失控，最终形成肿瘤。PCR扩增检测技术，使癌基因和抑癌基因及其状态的检测。变得简便，快捷而双容易。使用PCR方法测定外周血和（或）骨髓免疫球蛋白重链（IgH）和κ链（Igκ）基因可扩散的大B细胞淋巴瘤的预后进行评估，还可对该病进行分子分期，并可从分子水平确定出有正常骨髓组织学，但5年生存率低的患者[14]。在白血病的治疗中，采用PCR方法可灵敏的检出微量的残留[15]。此外，使用反转录PCR检测特定肿瘤抗原的mRNA，很容易监测到癌转移的发生[16，17]。
　　二、PCR在临床检验应用中的局限性
　　PCR作为一种简便高效的基因扩增技术，已成为临床分子诊断的最有力的工具，但在应用中，如不严格遵守操作规范，也很容易出现错误的结果，因为临床检验与科研不同，在五百次科研实验中，即使出现四百九十九次失败，只要第五百次成功了，该项科研就是成功的，而临床检验，则是应用一种成熟的方法与技术，通常用商品试剂盒去检测患者的临床标本，要求做到每次临床检测，乃至对每份标本的检测都要准确和及时，要做到这一点，就必须有严格的质量保证程序。临床PCR检验相对于其它临床检验技术而言，虽然具有极高的检测灵敏度，但影响因素也很大，如标本或核酸纯化过程中出现扩增反应抑制物、扩增仪孔间温度的差异以及核酸提取中的随机误差，均可造成假阴性结果的出现。又如，以前扩增产物的污染和核酸提取中标本间的交叉污染，也很容易出现假阳性结果。因此，在PCR临床应用中，必须围绕怎样防止假阳性和假阴性结果的出现，而采取相应的质量保证措施[18，21]。
　　为防止假阳性结果，实验室首先要严格的分区，根据所用的PCR技术可分为试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物分析区等3至4个区。同时各区的物品如工作服、试管架、架样器、记号笔、乃至实验记录本等都不得混用。为防止并监测实验过程中标本之间的交叉污染，除在移液时使用滤心的吸头外，还应用一定数量的阴性质控样本，这些队性质控样本应与临床标本一起处理，并适当散在分布于不同标本之间，从而最大限度的监测和防止操作过程中的污染。
　　假阴性结果通常是由于在临床标本核酸提取过程中，靶核酸的丢失和提取试剂（如有机溶剂等）的残留、标本中的抑制物的去除不彻底、扩增仪孔间温度差异等所致。避免假阴性结果最有效的措施是设立“内标”[22，23]。用于假阴性质控的内标一般为竞争性内标，即所用引物序列、扩增片段长短、片段的G+G%等均与待扩增检测靶序列相同或尽可能相近，所不同的是，在片段内通过突变，缺失或插入待方式使内标与靶序列之间可使用电泳、层析或探针杂交的方法加以区分。如果一加有内标的反应管内，内标没有出现扩增，标本检测亦为阴性，则很可能为假阳性，此时，需要采取进一步的措施，如重新进行核酸提限，重新校准仪器孔内温度可稀释标本等，然后，再重新扩增检测标本，反之，则为真阴性。
　　由于PCR方法扩增检测的是核酸，在临床病原体检测中，还要注意“临床假阳性”的问题。“临床假阳性“就是患者临床症状已消失，但PCR检测仍为阳性现象，如淋病奈瑟菌感染患用抗生素治疗后，尽管淋病奈瑟菌已被杀死，患者症状消失，但由于泌尿生殖分泌物仍有死的细菌存在，故PCR仍可为阳性，此为“临床假阳性”，即细菌已杀死，但PCR仍为阳性，与临床症状不符。因此，在采用PCR方法检测细菌感染时，为避免临床上的假阳性，应在应用抗生素治疗1个疗程结束2周后进行PCR检测。
　　此外，在使用PCR方法定量检测病毒核酸，以监测患者抗病毒治疗效果时，不能以两三次检测结果为依据，要考虑到PCR广泛得到的结果有一定的正常波动范围。目前国内应用最广的实时荧光PCR方法，结果的波动在一个数量级属于没有改变。正确的做法是，对较长治疗周期的患者，定期（两周检测1次）检测，动态观察其变化趋势，从较高浓度如108拷贝/ml降至较低浓度104拷贝/ml，并持续稳定在低水平，才能说明治疗有效。
　　综上所述，PCR方法在临床分子诊断中已展现了巨大的应用价值，但临床实验室必须在充分了解PCR测定的不确定性基础上，采取相应质控措施，才能确保试验结果的准确性，而不致出现重大判断失误，因为PCR扩增，其可得到极在原检测灵敏度，但同时其对检测中的错误也有极大的放大作用。因此，对于PCR检测结果的报告必须慎重，尤其是在该结果会产生重大后果的时候，如重大感染性疾病、遗传病、法医物证鉴定、亲子鉴定等，必须有相应严格质量控制措施，如内质控、阴性和阳性质控的情况下重复测定，原可报告检测结果，并对检测做出实事求是的解释。
　　三、临床PCR检验技术的发展趋势及展望
　　临床PCR检测与其它临床检验项目一样，在将检验结果的准确及时做为质量目标的同时，出希望检验方法尽可能的简便快捷。临床PCR检验最容易产生检验误差的环节，在于标本的核酸纯化，而自动化核酸纯化仪的研制应用将大大提高临床PCR检验的准确性和重复性，在检验项目方面，目前国内临床基因扩增检验主要是在病原体的检测上，今后在其它基因相关疾病，如与遗传基因相关的疾病、肿瘤、耐药性检测等，都将有着广阔的应用前景，随着多基因标志物同时检测技术逐步成为现实，疾病基因指纹的检测将不再是梦想。基于荧光共振能量转移原理的实时灾光PCR仪的应用，不但简化了临床基因扩增检验操作，而且降低了扩增产物污染的可能性，通过设计软件，采用动力学方法计算扩增效率，再确定靶核酸的量，将克服目前外标方法的检测变异较大的问题。试剂改进尤其是核酸提取试剂的标准化，以及临床检验程序的标准化，将从源头减少误差产生的几率，而各临床PCR检验项目标准物质的研制也将为临床PCR检验的标准化提供有力的保证。

摘自：《中华检验医学杂志》2005年3月第28卷第3期