Microsphere Bead Arrays and Sequence Validation of 5/7/9T Genotypes for Multiplex Screening of Cystic Fibrosis Polymorphisms

Andrew G. Hadd, Walairat Laosinchai-Wolf, Chris R. Novak, et al.Journal of Molecular Diagnostics, 2004，6(4): 348-355

目的：囊性纤维化病(CF)是白种人中最常见的致死性常染色体隐性遗传病。美国医疗遗传协会（ACMG）以及美国妇产科协会(ACOG)强烈呼吁要对新生儿普查并推荐了CFTR中25个CF中最常见的检测位点以及6个新增的多态性位点。本文旨在研究液芯技术对CFTR基因内含子8上Poly T（5T/7T9T）的变异情况检测的方法。

方法：针对Poly T（5T/7T9T）设计出5T、7T、9T的特异性探针分别共价交联在三种不同颜色的微球上并对杂交效果进行检测；CETR中内含子8的特异性引物对来自29个商业途径的CF阳性标本扩增，扩增产物无需纯化直接和交联探针的微球杂交，整个过程中还研究5T/7T9T与不同微球间的交叉反应并优化反应系统。各标本的Poly T基因型由每种探针上的荧光信号来分类。

结果：利用各探针的互补单链寡核苷酸来检测特异性反应与交叉反应的情况时发现随着寡核苷酸量的增加，特异性反应信号值的增加大大超过交叉反应，交叉反应不会影响特异性反应；未纯化的PCR产物和微球杂交的过程中，特异性反应的集中在2000MFI左右，而交叉反应的值最大不会超过80MFI；在此29个标本中，基因型的情况分别是：2个5T/7T，2个5T/9T，9个7T/9T，11个7T/7T，5个9T/9T。整套检测方法在对来自全血标本DNA样本的检测范围可以从10ng到1000ng。

结论：这种基于微球的多指标检测系统是C F检测中的一种简便、快速多态性位点检测方法，经过优化后的方法可广泛的运用在临床实验室诊断中。